生物學(xué)檢測方法研究生物活性物質(zhì)之間相互作用及其影響，或者利用生物活性物質(zhì)之間相互作用進(jìn)行定量，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域和藥物研發(fā)過程中必不可少的工具。有別于色譜質(zhì)譜拉曼光譜等儀器分析方法，生物學(xué)檢測方法往往是間接的，其間接性導(dǎo)致方法可靠性，穩(wěn)定性等相對于儀器分析方法較差。從整體宏觀的角度了解生物學(xué)檢測方法的間接性是建立一個(gè)穩(wěn)定的生物學(xué)檢測方法的關(guān)鍵因素之一。

儀器分析方法(a)研究的是樣品本身直接相關(guān)的特性，如樣品的分子量大小，樣品的電荷等；與此相對，生物學(xué)檢測方法（b）首先要存在或者建立一個(gè)Test system，然后加入樣品反應(yīng)，檢測樣品引起Test system的變化，其檢測和樣品本身是間接相關(guān)，檢測目標(biāo)分子實(shí)體不是樣品本身，這是其檢測目標(biāo)的間接性。如某藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)，Test system為細(xì)胞，引起的變化是細(xì)胞的死亡，檢測目標(biāo)分子實(shí)體為代表活細(xì)胞的ATP濃度或者代表死細(xì)胞的LDH濃度。 

大多數(shù)生物學(xué)檢測方法存在一個(gè)復(fù)雜的Test system，樣品引起Test system的變化也需要在溫和的條件下進(jìn)行，這使得目標(biāo)分子很難進(jìn)行有效的分離并采用儀器分析方法進(jìn)行檢測，需要引入熒光標(biāo)記抗體，酶標(biāo)抗體，或酶催化底物等和目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)轉(zhuǎn)換成信號值，建立信號值和目標(biāo)分子的間接聯(lián)系，這是檢測信號傳遞的間接性。如下圖所示，在一個(gè)ELISA直接法的實(shí)驗(yàn)中，樣品是抗體，檢測體系是抗原，引起的變化目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物，而信號值代表的是TMB催化產(chǎn)物，TMB催化產(chǎn)物經(jīng)過酶標(biāo)抗體和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物發(fā)生間接聯(lián)系，一個(gè)ELISA方法的質(zhì)量是由信號在間接的傳遞過程中是否和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物線性相關(guān)決定的。相關(guān)研究請參閱小編之前的文章ELISA常用原理類型方法和常見問題匯總

生物學(xué)功能評價(jià)和檢測分析方法的雙重間接性為檢測目標(biāo)的間接性和檢測信號傳遞的間接性。即使最為簡單的生物學(xué)檢測方法，配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的應(yīng)用過程中由于這兩重的間接性導(dǎo)致其方法也變得無比復(fù)雜，存在很多的變量，很容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的結(jié)果。一個(gè)檢測方法在方法開發(fā)的初期往往需要進(jìn)行分步的實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化方法的可靠性和穩(wěn)定性，并對建立的方法進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證。明確需要檢測的目標(biāo)分子，信號和目標(biāo)分子的關(guān)聯(lián)途徑是進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)，數(shù)據(jù)解讀和問題排查的基礎(chǔ)。

一般來講，競爭法實(shí)驗(yàn)主要涉及到三個(gè)物質(zhì)，受體，配體和阻斷配體受體結(jié)合的樣品，如PD1受體，PD-L1配體，阻斷劑keyturda抗體，也常采用抗原，生物素化抗體，和阻斷抗原，生物素化抗體的樣品抗體組合。在競爭法開發(fā)的初期是建立起受體，配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競爭法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和測量范圍。具體到ELISA競爭法方法開發(fā)上，主要包含兩個(gè)方面：

1.設(shè)置多個(gè)陰性陽性對照組，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)信號值是真實(shí)代表目標(biāo)分子配體受體偶聯(lián)物。主要考察的是在間接的檢測過程中ELISA反應(yīng)過程采用的酶標(biāo)板材，酶聯(lián)抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示，嚴(yán)格來講在新建一個(gè)ELISA方法時(shí)，需要建立一個(gè)陽性反應(yīng)組組5，需要建立多個(gè)陰性對照組組1-組4來確認(rèn)Test system中信號是和目標(biāo)分子相關(guān)。這是一個(gè)十分重要，也是十分容易被忽略的問題。除了組5能夠得較高的陽性信號，其他分組如果得到較強(qiáng)的陽性信號，整個(gè)方法得到的數(shù)據(jù)都是不可信的。組3和組5（黃色）是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的對照組，但是組4（藍(lán)色）的缺席會(huì)使得整個(gè)方法充滿分險(xiǎn)性，小編多個(gè)不同ELISA應(yīng)用方法學(xué)開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)表明，很多時(shí)候封閉劑起無法達(dá)到占據(jù)酶標(biāo)板材空白位置的目的，反應(yīng)配體或者反應(yīng)配體中的非特異成分可能會(huì)直接吸附在酶標(biāo)板材上，導(dǎo)致組4出現(xiàn)劑量依賴的假陽性信號。在雜交瘤和噬菌體展示篩選測定時(shí)，反應(yīng)配體溶液的復(fù)雜和多樣性，使得配體溶液總會(huì)存在某些陰性抗體或者克隆能夠和酶標(biāo)板材結(jié)合，成分組4的缺席會(huì)導(dǎo)致假陽性克隆出現(xiàn)的頻率大大增加。設(shè)置比較全的陰性對照組也有助于鎖定整個(gè)體系中哪些試劑發(fā)生了交叉反應(yīng)，找到具體原因，方便更換試劑。 

2.包被受體相對于反應(yīng)配體的劑量曲線。在確認(rèn)Test system中陽性信號能夠代表目標(biāo)檢測分子后，包被少量的受體，2倍梯度稀釋反應(yīng)配體12-16個(gè)點(diǎn)進(jìn)行全曲線擬合，選取EC80或者EC50的配體濃度作為競爭法反應(yīng)濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被，受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml，采用不同稀釋濃度的酶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測，整個(gè)劑量曲線有明顯的上，下平臺(tái)期，不同的酶聯(lián)濃度對信號的線性傳遞未造成明顯的影響，酶聯(lián)抗體起到了等比例將信號放大的作用，EC50為12ng/ml，EC80為40ng/ml。可選取100ng/ml 受體100ul包被，配體的競爭濃度選EC80為40ng/ml，酶聯(lián)稀釋度選擇1：600以獲得較大的信噪比窗口，增加方法測量范圍。在競爭法實(shí)驗(yàn)中EC80代表了配體在Test system中占據(jù)了受體80%的結(jié)合位點(diǎn)，配體和受體在此相對狀態(tài)下，樣品對配體和受體的反應(yīng)的阻斷比較敏感。受體過多，可提供的結(jié)合位點(diǎn)較多，樣品和受體結(jié)合不會(huì)影響到配體和受體的結(jié)合；配體過多，樣品加入后相對于配體較少，競爭不過配體，絕大多數(shù)配體依舊和受體結(jié)合，在兩種情況下樣品的加入都無法導(dǎo)致Test system發(fā)生明顯的變化（配體受體偶聯(lián)物減少），信號變化不明顯。 

建立好完整的Test system后，就是正式建立競爭法的劑量曲線了。主要包含兩個(gè)方面的內(nèi)容

1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品（2倍梯度稀釋12-16個(gè)點(diǎn)）混勻后加入包被好受體的酶標(biāo)板材反應(yīng)，得到有明顯上下漸近線的全曲線，如下圖所示。 

2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行，選擇樣品合適的8個(gè)濃度梯度點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡化實(shí)驗(yàn)操作流程，并初步評估方法的質(zhì)量。具體到應(yīng)用方面就是親和力大小比較和定量檢測方面。根據(jù)筆者的對比研究，發(fā)現(xiàn)ELISA競爭法相同條件下的同一個(gè)曲線在濃度點(diǎn)細(xì)微調(diào)整下能夠滿足兩方面的需求，這是筆者開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，希望業(yè)界更多的同行能夠進(jìn)行驗(yàn)證。下文會(huì)具體進(jìn)行兩方面應(yīng)用方法的初步評估。

當(dāng)ELISA競爭法開發(fā)以親和力大小比較為目的，往往會(huì)以IC50值評價(jià)待測樣品阻斷配體受體結(jié)合效果，IC50越小，待測樣品的阻斷效果越好。親和力競爭法開發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺(tái)期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體到ELISA競爭法的方法學(xué)評價(jià)，即制備相對于對照品理論效價(jià)為156%，125%，100%，80%，64%的樣品進(jìn)行檢測，通過比較對照品和樣品的IC50，得到樣品相對于實(shí)測效價(jià)，通過實(shí)測效價(jià)和理論效價(jià)的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的ELISA競爭法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示：該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)測效價(jià)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中最主要的幾個(gè)概念，精密度，準(zhǔn)確度，線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測效價(jià)和理論效價(jià)的差異在5%以內(nèi)，能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的ELISA競爭法有較好的方法質(zhì)量。 

當(dāng)ELISA競爭法開發(fā)以定量為目的，選取7個(gè)點(diǎn)以理論濃度為X軸，信號值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對照品的信號值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測濃度值，多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測上限，檢測下限，測量范圍，更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。如下圖所示，對照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi)，回測濃度值和理論濃度的偏差在20%以內(nèi)，初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺(tái)期的最低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺(tái)期點(diǎn)會(huì)嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。

本文以ELISA競爭法方法學(xué)開發(fā)和初步方法學(xué)驗(yàn)證的案例概論了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)的通用原則，包含以下幾個(gè)步驟：

1. 鑒于生物學(xué)方法的雙重間接性，明確檢測的目標(biāo)分子，設(shè)置多個(gè)陽性對照組和陰性對照組，理清信號值和檢測目標(biāo)分子的線性聯(lián)系；

2. 建立Test system，通過配體受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，尋找合適的配體受體相對濃度以得到樣品對Test system的敏感性；

3. 加入梯度稀釋的樣品進(jìn)入Test system，繪制樣品相對于Test system的劑量全曲線；

4. 以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑閷?dǎo)向，分別對親和力大小比較為目的和大分子定量為目的進(jìn)行差異的濃度點(diǎn)選擇，并通過合規(guī)的方法學(xué)評價(jià)程序?qū)Ψ椒ǖ馁|(zhì)量進(jìn)行初步的評價(jià)。 

ELISA直接法和ELISA競爭法有相同的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)，即親和力大小比較的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)USP1032,1033,1034；定量分析的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA競爭法在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對于對照品濃度點(diǎn)的微調(diào)可以完成親和力大小比較和大分子定量兩方面應(yīng)用，這個(gè)有別于筆者之前的文章ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析對于ELISA直接法兩方面不同應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)條件，但是兩類方法的四種應(yīng)用均能夠通過驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)要求，只能說實(shí)踐出真知，不管白貓黑貓，能抓住老鼠的就是好貓了。

在體外所有的體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，樣品引起檢測體系的變化，并以信號的形式展示出來，這個(gè)應(yīng)該是體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法最通用的原則，有結(jié)合才會(huì)有功能，功能是對藥物引起的變化（響應(yīng)標(biāo)志物）的準(zhǔn)確定量。理解ELISA實(shí)驗(yàn)關(guān)于結(jié)合和定量的應(yīng)用以及方法質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)對于所有的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的開發(fā)和評價(jià)都有著十分重要的借鑒意義，ELISA里面有乾坤。

2012安進(jìn)公司的科學(xué)家宣稱53項(xiàng)癌癥著名論文中有47項(xiàng)無法重復(fù)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，在追求創(chuàng)新性，第一性的同時(shí)，臨床前研究結(jié)果可重復(fù)性差，這個(gè)值得我們從業(yè)者去反思，也許基礎(chǔ)研究領(lǐng)域需要借鑒藥物研發(fā)企業(yè)的一些經(jīng)驗(yàn)，做好生物功能學(xué)方法開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證的工作，在得到陽性結(jié)果前，先問一句，用來得到此陽性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)方法是否可靠？